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CCR3在哮喘豚鼠模型肺和骨髓中的表达及

2017-12-9 5:00:00 手机版
又是一年毕业季!论文这个字眼对于上过大学的人来说都不陌生,甚至有的人提起它仍心有余悸,而那些没写过的听之闻风丧胆。下面课后学习网小编给大家带来一篇论文范文,欢迎阅读!
      【摘要】 目的 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织嗜酸粒细胞趋化因子受体3(ccr3)及嗜酸粒细胞(eos)不同时相表达的变化, 探讨哮喘发病的可能机制。方法 用卵白蛋白(ova)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型, 分为正常对照组(n)及哮喘组(a、b、c、d、e),每组8只,于激发后30 min,6 h,12 h,24 h,48 h处死,瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中eos比例,免疫组织化学技术检测骨髓中ccr3的表达;制备豚鼠肺组织病理标本, 苏木精-伊红染色,免疫组化检测肺组织中ccr3的表达。结果 ①哮喘组骨髓和外周ccr3及eos表达明显增加;②ova激发后,骨髓和外周ccr3及eos表达:30 min变化不明显,6 h,12 h达到峰值,24 h开始下降,48 h恢复正常水平;③骨髓的变化早于外周,ccr3的表达早于eos的增多,且ccr3和eos呈线性相关。结论 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓eos细胞到循环再到肺组织的通路,ccr3表达增强, 为eos从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。
  【关键词】 支气管哮喘 ccr3 eos 骨髓 豚鼠
  哮喘是多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症疾患,哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞(eos)的浸润和活化。气道黏膜下的 eos主要来源于骨髓cd34+干细胞在某些信号(如eotaxin,il-5)的驱动下分化成熟为eos,释放入外周血,在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓-循环-气道,存在着调控eos定向迁移的信号通路。在eos趋化、募集于肺组织内的过程中,嗜酸粒细胞趋化因子受体3(ccr3)起着重要作用。本实验探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控eos定向迁移信号通路;为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。
  1 材料和方法
  1.1 材料 雄性豚鼠48只, 体重(250±50) g,由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组(n)、哮喘组(根据处死时间分为a、b、c、d、e组), 每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin, ova,美国sigma公司)、ccr3多克隆抗体及sabc免疫组化试剂盒(武汉boster公司) 、奥林巴斯图像采集系统、德国百瑞雾化器和自制雾化箱。
  1.2 方 法
  1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1ml (ova 100 mg、氢氧化铝200 mg) , 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内, 喷射雾化吸入10 g/l ova 20 min,连续5天[1]。对照组于第1天腹腔注射1 ml生理盐水, 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min,连续5天。最后1次雾化吸入后,哮喘组a、b、c、d、e分别于30 min,6 h,12 h,24 h,48 h处死动物,对照组12 h处死,取材并作相应测定。
  1.2.2 骨髓和外周血eos计数 于末次激发后,断颈处死豚鼠, 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨, 去掉两端骨骺, 剖开骨干髓腔,以含肝素100 u/ml的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出, 4℃,1000 r/min离心5 min后,沉渣涂于多聚赖氨酸处理的玻片上,干燥后以40 g/l多聚甲醛固定30 min,-20℃保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色, 随机计数200个白细胞, 并计算其中eos百分比。
  1.2.3 骨髓细胞ccr3表达的检测 采用sabc免疫组织化学法检测骨髓中ccr3的表达。以兔抗大鼠ccr3 igg为一抗, 以生物素化的羊抗兔igg为二抗。取骨髓沉渣涂片, 按sabc免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果,胞膜为棕黄色者为阳性细胞, 在光镜(×400) 下随机选取5个视野, 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例, 结果以±s表示。
  1.2.4 肺组织eos计数及ccr3表达的检测 无菌操作下切取部分肺组织,40 g/l多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、切片, 分别进行h-e染色、ccr3免疫组化染色(严格按武汉boster公司sabc试剂盒说明书操作)。肺组织切片h-e染色后, 每张切片计数200个细胞, 计算其中eos百分比。免疫组化计数方法: 光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片, 显微镜下随机选取5个高倍视野(×400) , 计数, 取每视野的均数, 结果以±s表示。
  1.2.5 统计学处理 计量数据均采用±s表示,用 stata7.0软件对数据进行t检验和相关分析,p<0.05为差异有统计学意义。
  2 结 果
  2.1 哮喘豚鼠气道病理学改变 肺组织h-e染色光镜下可见:与对照组相比,哮喘组大、中、小支气管收缩,黏膜水肿,平滑肌增厚,上皮细胞肿胀,部分上皮细胞变性、坏死脱落,杯状细胞增生,支气管管腔狭窄甚至闭塞,黏液栓形成;支气管周围血管扩张、充血,黏膜、黏膜下层及肺泡区有大量的炎症细胞浸润,主要为eos、淋巴细胞、单核细胞;肺泡间隔增厚。激发后30 min上述改变不明显,6 h,12 h肺组织病变最明显,24 h,48 h逐渐恢复到正常肺组织表现。见图1。
  2.2 外周血涂片、骨髓细胞涂片及肺组织eos计数 结果见表1。可以发现哮喘(豚鼠)激发后30 min,与对照组相比变化不大,且外周血eos百分比稍有下降,但无统计学意义;6 h,12 h升高明显(p<0.01);24 h开始下降(p<0.05);48h基本恢复到正常水平。值得注意的是哮喘组不同时间点之间eos也存在着变化:6 h较30 min,eos升高明显(p<0.01);12 h较6 h,肺组织eos变化不大(p>0.05),骨髓和外周血升高(p<0.05);24 h较12 h,48 h较24 h,eos呈下降趋势(p<0.01).可以看出在6 h,12 h时eos增多最明显,与气道病理学改变相一致,24 h开始下降,48 h回到正常水平。骨髓的变化先于肺和外周血,且持续的时间短。
  2.3 肺组织和骨髓中ccr3蛋白的表达 结果见表2。 哮喘组肺组织和骨髓中ccr3 蛋白阳性细胞呈棕黄色,主要定位于细胞膜。肺组织中,气道黏膜、黏膜下层及血管周围、肺泡区有大量呈棕黄色的阳性细胞,气道黏膜上皮细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞也有ccr3蛋白表达,对照组在上述部位仅少量表达。骨髓细胞中,呈棕黄色ccr3 蛋白阳性细胞大量表达于各阶段eos细胞表面,见图2。不同之间点的表达趋势和eos的变化一致:与对照组相比骨髓及肺组织中ccr3 30 min时开始升高(p<0.05); 6 h、12 h达到高峰(p<0.01);24 h开始下降(p<0.05);48 h基本恢复到正常水平。哮喘组不同时间点之间ccr3表达也存在着变化:6 h较30 min升高明显(p<0.01);12 h较6 h,肺组织继续升高(p<0.05),骨髓中持续高峰(p>0.05);24 h较12 h,48 h较24 h渐下降至正常水平(p<0.01)。骨髓先升高,肺组织随着变化,但持续时间长于骨髓。 表1 对照组、哮喘组的eos计数表2 肺组织和骨髓中ccr3 蛋白的表达2.4 肺组织和骨髓eos表达与ccr3蛋白表达的关系 eos表达与ccr3蛋白的表达存在着线性关系:肺组织,r=0.93,p<0.01;骨髓,r=0.95,p<0.01。
  3 讨 论
  ccr3主要由单一肽链组成的7个螺旋跨膜结构,属于g 蛋白藕联受体家族。ccr3 主要表达于eos上,介导其迁移及脱颗粒反应。shannon a 等[2]研究发现eotaxin及eotaxin-2 通过与ccr3的结合可以诱导部分ccr3内陷和eos 的变形,有助于eos 的活化和迁移。joubert p 等[3]发现eotaxin 作用于气道平滑肌细胞ccr3可诱导平滑肌细胞迁移和增殖,使细胞内ca2+增高。adachi t 等[4]发现支气管上皮细胞表达ccr3 可激活和诱导有丝分裂原激活蛋白(map)活化和细胞因子的产生。可见ccr3无论在气道炎症还是重塑方面都起到了重要作用。本实验发现哮喘时不但肺组织eos浸润明显,ccr3表达增加,而且黏膜上皮细胞、平滑肌细胞上ccr3也有明显表达,平滑肌增厚,和既往研究一致。
  以往研究表明, 在过敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的eos ccr3表达水平显著升高[5]。lamkhioued等[6]研究证实,ccr3 可表达于骨髓cd34+造血细胞表面,在体内外eotaxin 与ccr3 结合后均表现出明显的趋化活性,促使骨髓中cd34+细胞产生增多。并且单独或与il-5协同作用可以使骨髓cd34+祖细胞定向分化为eos,并向外释放、募集[7]。本实验发现哮喘组骨髓ccr3表达明显高于对照组,与eos各级细胞呈线性相关,并且ccr3的表达高峰在6 h,早于eos增加,释放的高峰时间12 h,说明在某些因子的作用下,骨髓祖细胞表达ccr3,进一步使eos分化、释放增多,利于炎症的发展。
  近年研究的重点倾向于骨髓、肺组织、循环之间的关系,以便更好地为治疗哮喘开阔思路。本实验发现无论肺组织还是骨髓在哮喘激发初始时变化不明显,但是外周血eos呈下降趋势,考虑为向肺内募集量大于骨髓释放量;在6 h后,骨髓ccr3和eos均明显增加,外周血eos增多,肺内表达增多,12 h达到高峰,24 h开始下降,说明伴随骨髓干细胞ccr3表达增加,eos增多、释放,外周的eos也在变化。证明在骨髓到外周血再到肺组织存在着密切的细胞信号环路联系。如果能切断这方面的环路,如通过抑制ccr3的表达,或者给于其拮抗剂,将对哮喘的治疗有很重要的意义。

 

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